微信公众号

版权所有:南京尧顺禹生物科技有限公司

备案号:苏ICP备12063614号-2

网站建设:中企动力  南京


浏览量:

斑马鱼基因敲除突变体建立

1.敲除原理

  功能缺失---基因敲除 (Gene Knockout)

  基因敲除 :将斑马鱼基因改变成无功能性基因(无效等位基因:null allele)的一种遗传学技术

  【A gene knockout (KO) is a genetic technique in which one of an organism‘s genes is made inoperative. http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockout 】

  通过将基因敲除的个体与正常个体相比较,研究者可以揭示特定基因的功能。

  基因敲除技术特点:在基因组水平上将目标基因修改成无效等位基因,遗传背景干净清晰,是研究基因功能的金标准。

 

2.服务流程

 

3.服务信息

流程分布

周期(工作日)

提交内容

基因信息分析

2

专业分析报告

sgRNA合成

9

获得sgRNA并提供sgRNA合成阶段报告

sgRNA活性验证

5-10

获得有活性的sgRNA并提供活性报告

F0代突变体鉴定

40

获得F0代突变体3对并提供鉴定报告

F1代突变体获得

60

提供3尾F1代突变体并提供总结报告

总周期:5-6个月

 

 

案例说明
案例展示

案例说明

利用CRISPR技术建立动物基因敲除突变体的实验流程

(以斑马鱼基因为例)

  一、基因结构及功能的生物信息学分析

  二、CRISPR 设计

  三、目标序列的野生型等位基因的测序验证

  3.1 扩增目标基因组片段的引物设计

  3.2 基因组DNA模板制备

  以斑马鱼为例,随机选取5枚24 hpf胚胎,以《超微量基因组DNA模板制备试剂盒》(南京尧顺禹生物科技有限公司)制备斑马鱼基因组DNA模板。

  3.3 PCR产物电泳及测序验证

  四、sgRNA体外表达模板的制备(质粒模板法)

  本实验流程以南京尧顺禹生物科技公司的二合一质粒pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA(含sgRNA骨架的质粒)质粒特征所设计。

  4.1 CRISPR寡核苷酸DNA(Oligo)对的设计

  4.2 向可信赖的商业公司订购上述DNA引物(共2条,每个2 OD,RPC纯化即可)。

  4.3 将正反向两个引物进行退火

  4.4 将退火产物与线性化的pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA骨架质粒连接

  4.5 转化

  4.6 转化子鉴定

  2%琼脂糖凝胶电泳,阳性克隆应出现113 bp的条带(图1):

  

 

图1:PCR验证阳性克隆。Lane1:DNA Marker (从下往上, 100bp, 250 bp, 500bp, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp);Lane 2-4: 阴性转化子; Lane 5-9: 阳性转化子

  4.7 测序验证

  送2个经PCR验证有阳性条带的菌液去商业公司测序,测序引物为F-sgRNA,确认CRISPR序列(去除PAM位点)和骨架序列重组到pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA质粒中;同时,将同样的细菌接种在10 ml含氨苄青霉素的LB管中,37oC条件下摇菌过夜。

  4.8 质粒抽提

  4.9 sgRNA模板的制备

  以上述质粒为模板,选用引物F-sgRNA和引物R-sgRNA作为一对引物,用高保真DNA聚合酶,通过PCR的方式,进行sgRNA模板的制备。

  五、sgRNA体外转录

  用Maxiscript T7 Kit (Ambion)试剂盒,按说明书的要求进行sgRNA的体外转录。

  说明:由于sgRNA在细胞内发挥作用的是RNA的形式,因而不需要戴帽以及加尾等操作。

  5.1 20 ml体外转录体系(依次加入)

  sgRNA模板:12 ml

  10mM ATP: 1 ml (NTP均需在冰上溶解)

  10mM CTP: 1 ml

  10mM GTP: 1 ml

  10mM UTP: 1 ml

  T7 RNA polymerase:2 ml

  10 × Transcription Buffer:2 ml (先在室温下溶解,然后Vortex,再离心后使用)

  5.2 将上述溶液充分混匀后,离心,然后置于37℃水浴锅中孵育1h。

  5.3 向反应体系中加入1ml DNase I,混匀,再次于37℃水浴锅中孵育15min。

  5.4 向反应体系中加80 ml DEPC处理过的超纯水,10 ml 无RNase的3M醋酸钠(pH5.2),涡旋混匀,然后加300 ml 无RNase的无水乙醇(购买来未打开过的新的无水乙醇可视为无RNase,于-20℃中骤冷1小时以上。

  5.5 4℃,12000g 离心20min,弃上清。

  5.6 以70% 无RNase的乙醇清洗沉淀,4℃,12000g 离心5min,弃上清。

  5.7 然后再快速离心,将挂在离心管壁上的液体用移液器小心吸出。

  5.8 通风橱中(打开抽气开关)干燥(20min左右),若较长时间仍不能将沉淀物干燥,再次于4℃,12000g 离心5min,将挂在离心管壁上的液体用移液器(小量程的移液器)小心吸出。

  5.9 加10 ml DEPC处理超纯H2O 溶解沉淀。

  5.10 取0.5 ml sgRNA用2%的琼脂糖凝胶电泳检测转录出的sgRNA条带的完整性(图2),并用紫外分光光度计测量转录出的sgRNA的浓度。

  5.11 合成出的sgRNA应及时进行分装,保存在-80oC冰箱中,不要反复冻融,以免影响其质量。

  

 

图2、sgRNA (第2条泳道为sgRNA)

  六、sgRNA活性的测试

  将上述sgRNA和Cas9 蛋白混合,显微注入斑马鱼受精卵,注射量为1nl。待胚胎发育至7-24 hpf时,取5枚胚胎,使用本公司生产的《超微量基因组DNA模板制备试剂盒》制备基因组DNA模板,方法同前。

  然后以引物对F-gene和R-gene进行PCR扩增,将PCR产物分别亚克隆到pGEM-T Easy载体中。以引物对T7和Sp6对转化子进行扩增,以筛选验证。

  对筛选到的阳性转化子,以T7和Sp6扩增产物为模板,F-gene和R-gene再次进行PCR扩增。然后,依据条带大小,选20个克隆,5个一组,PCR产物等量混合后直接送测序。直接阅读测序图,只要其中任何一组出现有套峰,即假定制备的sgRNA活性不小于5%(1/20)。

  

 

图4 典型的测序套峰图

  七、斑马鱼靶向基因突变体F0代的建立

  将上述经过验证有活性的sgRNA和Cas9 蛋白等量混合后,按上述相同的方法显微注入斑马鱼受精卵。然后将按常规饲养,当生长至两月龄时,剪取尾鳍,按前述同样的方法进行扩增目标基因组DNA片段。将获得的PCR产物直接送测序,确认体细胞含靶向突变。然后将斑马鱼饲养至性成熟,共获得约50尾后代。

  

 

图5 典型的体细胞含靶向突变的测序套峰图

  八、斑马鱼基因靶向突变F1代的制备

  收取F0自交的胚胎,获得不少于100尾以上的F1。将F1按常规饲养至2个月时,选取10尾鱼,剪尾鳍,按前述方法进行基因型鉴定。简单地说,用南京尧顺禹生物科技有限公司的《超微量基因组DNA模板制备试剂盒》制备基因组DNA模板,再以引物对F-gene和R-gene进行PCR扩增。将PCR产物直接送测序,通过直接读测序的色谱图,确认每一位鱼是否携带等位基因突变。

  九、基因靶向突变体的扩群建系

  将携带基因靶向突变的F1突变体和野生型交配,获得F2群,完成基因靶向突变体的建系扩群。

参考文献
参考文献

参考文献

参考文献

技术咨询