人类疾病的斑马鱼模型-----斑马鱼胚胎药筛平台

　　斑马鱼在国际上已广泛应用于药物早期安全性评价和毒理学研究，辉瑞、默克、强生、阿斯利康等跨国医药巨头都在用斑马鱼进行药物早期安全性评价。FDA和EMA早在2009年就通过了对斑马鱼安全药理学数据的GLP检查。中国重大新药创制专项自2012年开始将斑马鱼药物安全性评价技术列为了关键技术开发课题之一，并连续滚动支持。随着斑马鱼全基因组和人类基因组相关性比对分析工作的完成，斑马鱼在人类疾病未知基因研究、疾病表型分析以及通过高通量体内药物筛选平台开发潜在治疗药物方面发挥了重要作用。

　　斑马鱼在药物筛选中有其独特的优势：它不仅具有体外细胞实验的优点，同时也作为脊椎动物具有体内实验的优势，完美的结合了体内外实验的优势。

　　与细胞模型相比具有生物、靶点和一药多筛的优势

　　生物优势：斑马鱼是整体作为药物受试对象，可同时监测药效和毒性，以便在实验开始时排除掉毒性大的化合物，大大降低误筛率；且斑马鱼胚胎透明，可镜下直视或通过免疫荧光、整体原位杂交等技术观察表型变化，降低药筛成本。

　　靶点优势：斑马鱼与人类基因的同源性高，可以针对某个生物学表型而不是靶点进行药筛，可以寻找到未知的药物靶点。

　　一药多筛：可同时观测分析多个器官系统的表型。

　　与哺乳动物小鼠相比具有高通量、低费用、给药方便等优势

　　高通量：斑马鱼产卵数量多，且受精后的7天卵黄可提供胚胎营养而不用喂食，方便用96孔或384孔板进行药物筛选；药物研发过程中，不是所有合成或者分离出来的化合物都能有理想的活性，往往需要对大批量的药物库逐步进行筛选，这时可以通过斑马鱼高通量筛选快速选出有活性的化合物（先导化合物），指导后续研发工作。

　　低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于实验鼠，平均每天每只消费约为实验鼠的1/100。

　　给药方便：斑马鱼皮肤具有通透性，给药过程简单，容易操作，而且易于进行大规模的药物筛选，可直接将化合物溶于水扩散至胚胎中，所需化合物的量仅为实验鼠的1/100-1/1000。

　　近年来，已经有一些研究团队使用斑马鱼在血液、心血管疾病、糖尿病和肥胖症、神经退行性疾病以及癌症等领域进行研究工作并取得一定的成果。

　　血液和心血管疾病

　　由于斑马鱼胚胎很小, 可以通过被动扩散跟环境交换氧气和二氧化碳, 所以即使没有血液循环,斑马鱼胚胎仍旧可以存活5 d ，非常有利于研究血液和心血管发育缺陷。

　　哈佛大学医学院的Zon课题组以造血干细胞分子标记runx1/cmyb 的表达谱为指标, 用斑马鱼胚胎来筛选调节造血的化合物, 发现了前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)能显著增加造血干细胞的数量, 同时又不引起胚胎发育异常。前列腺素E2在小鼠中具有同样的功能。尽管前列腺素E2 已经是临床药物, 主要用于引产, 但是以前人们并不知道它还能促进造血。目前, 前列腺素E2 的稳定修饰物16,16-Dimethyl Prostaglandin E2(dmPGE2)已进入临床研究。哈佛大学医学院与制药公司Fate Therapeutics等机构合作, 用dmPGE2 来促进人脐带血细胞移植后的增殖(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00890500)。dmPGE2 是第一个进入临床实验的始于斑马鱼筛选的药物, 有力的证明了斑马鱼药物筛选的效力和潜力。

Yunyun Yue, Mingyang Jiang, Luqingqing He, Zhaojunjie Zhang, Qinxin Zhang, Chun Gu, Meijing Liu, Nan Li, Qingshun Zhao*. 2018. The transcription factor Foxc1a in zebrafish directly regulates expression of nkx2.5, encoding a transcriptional regulator of cardiac progenitor cells. The Journal of Biological Chemistry, 293(2):638-650. 

糖尿病和肥胖症

　　神经退行性疾病

　　神经毒素1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) 能诱导哺乳动物帕金森病模型。斑马鱼的神经系统跟人类似, 胚胎用MPTP 处理后, 同样发生多巴胺能神经元数量减少和运动迟缓, 这种病理表型可以被Deprenyl 拯救,而且MPTP 和Deprenyl 的作用机制在人和斑马鱼间是保守的, 都要通过单胺氧化酶[44, 45]来起作用。可见, 斑马鱼是很好的帕金森病模型, 而且斑马鱼胚胎没有血脑屏障, 有利于药物进入脑。

Guo, S. (2009). Using zebrafish to assess the impact of drugs on neural development and function. Expert opinion on drug discovery 4, 715-726 

　　癌症

　　Zon 课题组用斑马鱼胚胎进行药物筛选, 发现了双氢乳清酸酯脱氢酶 (Dihydroorotate dehydrogenase, DHODH)的抑制剂, 比如来氟米特(Leflunomide), 能抑制神经脊细胞发育。在哺乳动物模型里的实验表明, 通过抑制DHODH 可以有效抑制黑素瘤在体外和体内的增殖。Leflunomide 也被批准进入了临床实验, 与Vemurafenib 联合用药治疗黑素瘤(ClinicalTrials.gov Identifier NCT01611675)。

（Patton, E.E., Widlund, H.R., Kutok, J.L., Kopani, K.R., Amatruda, J.F., Murphey, R.D., Berghmans, S., Mayhall, E.A., Traver, D., Fletcher, C.D., et al. (2005). BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB 15, 249-254 ）

　　药效学筛选和安全性评价

　　斑马鱼不仅可以适用于多种药物种类，还能进行多种类型的药效学评价和安全性评价。药物类型包括中药、天然产物、小分子药和成品药物（新适应症开发）。

　　药效学评价涉及领域：肿瘤、眼科、骨科、耳科、中枢神经、消化系统、脂质代谢、皮肤色素、组织再生、免疫与炎症等。

　　此外通过斑马鱼实验在早期能快速发现安全性不佳（干扰胚胎发育、引起表型变化等）的候选化合物，可以有效降低后期研发失败风险和成本，美国食品药品监督管理局（FDA）已经越来越多地应用斑马鱼对临床前药物进行安全性与毒理性评价。如美国FDA国际毒理研究中心（NCTR）评价氯胺酮（ketamine，一种被美国FDA严格管制的儿科麻醉剂）对斑马鱼心血管和神经系统的毒性，结果发现氯胺酮能够降低斑马鱼的心率，减少斑马鱼的运动神经元数量，和人类临床试验完全一致。

　　我们团队在赵庆顺教授的带领下，基于基因组编辑技术开发制备具备自主知识产权的人类疾病的斑马鱼模型，如斑马鱼心血管模型、肥胖症模型、运动神经模型、肿瘤模型等，取得了一定的研究成果，为生物医药产业链提供斑马鱼药筛平台这一重要的链接。